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干货分享 | 想菌种稳定？甘油冻存靠谱吗？
更新时间：2025-07-16
点击次数：152
菌种的长期稳定保存是微生物研究与生产应用的基础。若保存不当导致菌种失活或遗传变异，前期实验成果将可能前功尽弃。甘油冷冻保藏法因操作简便、成本低、保存周期长，成为实验室中常用的微生物保存方法之一。
作为实验室耗材专业服务商，爱津生物始终致力于为科研人员提供高品质、稳定可靠的耗材支持，涵盖菌种保藏、液体操作、细胞培养等多个环节，助力科研实验高效开展。
PART 01
甘油冷冻保藏法的优势
01 长期维持菌种活力
在-80°C或更低温环境下，添加甘油可延长微生物（如细菌、酵母等）的存活时间，通常可保存数年甚至十几年，为科研和工业提供稳定菌源。
02 降低冰晶对细菌损伤
在冷冻过程中，水形成的冰晶会破坏细胞膜和细胞器，导致细菌死亡。甘油作为冷冻保护剂，可从以下三方面发挥作用：其一，降低溶液的冰点，使溶液在更低温度下才会结冰；其二，减少冰晶的形成，降低冰晶的生长速度与大小；其三，与水分子结合，减少可用于形成大冰晶的自由水含量，同时稳定细胞膜和蛋白质结构，从而有效避免细胞因冰晶形成而受损。
03 保持菌种遗传稳定性
超低温几乎阻断微生物代谢，可有效降低基因突变或漂变的风险，有效维持菌种的原始遗传特性，是确保实验重复性的重要保障。
04 操作简便 适用性广
甘油冷冻保藏法所需材料常见、且操作步骤已形成标准化流程，新手实验员也能快速掌握。该方法适用于大多数细菌（包括好氧菌和厌氧菌）、酵母菌、部分丝状真菌以及某些噬菌体，不过对敏感菌种，可调整甘油浓度或搭配其他保护剂（如 DMSO）使用。
05 使用方便 成本经济
菌种通常以1-2mL的小份量分装冻存于冻存管中，使用时只需取出一管进行复苏，无需反复传代或划线操作，既降低了污染风险，也减少了菌种变异的可能。与液氮保存或商业化菌种保藏服务相比，甘油冷冻保藏法的成本更低，具有较高的性价比。
PART 02
细菌甘油冷冻保藏操作流程
所有操作必须在无菌条件下进行，建议在生物安全柜或超净工作台中进行。
01 准备工作
配制50% (v/v) 的无菌甘油溶液是首要步骤。将50mL分析纯甘油（建议进行高压灭菌或0.22μm滤膜过滤除菌处理）与50mL无菌蒸馏水（也可用生理盐水或培养基）充分混合。尽管甘油本身具有一定抑菌性，但为确保溶液无菌，灭菌或过滤除菌操作bi不可少。
02 菌种准备
平板法
使用无菌棉签或接种环，从新鲜、健康且处于对数生长后期的平板上挑取适量菌苔（约豌豆大小），将其悬浮于0.5 - 1mL无菌生理盐水或相应液体培养基中，制成浓菌悬液。
液体培养法
将菌种接种到合适的液体培养基（如 LB 肉汤）中，在适宜条件下振荡培养，当菌液 OD600 达到 0.6 - 1.0 左右（不同菌种略有差异），即菌体处于对数生长后期时，可用于保藏。此阶段的菌体生长状态良好，保藏成功率更高。
03 菌液与甘油混合
将制备好的浓菌悬液或对数期菌液与无菌的50%甘油溶液混合，使最终甘油浓度保持在15% - 20% (v/v) 。例如，取0.6mL 50%甘油与1.4mL菌液混合，可得到2mL含15%甘油的菌悬液；取0.8mL 50%甘油和1.2mL菌液混合，则可获得2mL含20%甘油的菌悬液。混合时需轻柔地上下颠倒或涡旋，确保菌液与甘油充分混匀。
04 分装与标记
迅速将混合均匀的菌液-甘油混合物分装到无菌的冷冻保存管中，每管分装 0.5 - 1.0mL 。同时，在管壁和管盖上清晰标明菌株名称 / 编号、保存日期、甘油浓度、操作者姓名等信息，以便后续准确取用和管理。
爱津生物提供多规格的冻存管，全部采用进口医疗级聚丙烯（PP）材质，具有高透明度、无毒无味，同时具备优异的密封性和耐化学性。它不仅能承受121℃/15psi的高温高压灭菌，还能在-196℃至121℃的温度范围内保持稳定，确保实验安全使用。
05 冷冻保存
可先将冻存管放入-20°C冰箱预冷1-2小时，随后转移至-80°C超低温冰箱进行速冻；也可使用专门的程序降温盒（如Mr. Frosty）。需避免缓慢冷冻（如在-20°C直接冻存过夜），因为缓慢冷冻会形成较大冰晶，对细胞造成损伤。若需长期保存，可将冻存管置于液氮气相环境中，但应避免反复冻融。
PART 03
菌种复苏
01 快速解冻
从-80°C冰箱取出目标冻存管后，立即放入37°C水浴（或适合菌种生长温度的水浴）中，轻轻摇晃，使冰晶在30秒到1分钟内融化。避免室温缓慢融化，以防活性降低。
02 消毒与接种
用70%酒精擦拭冻存管外壁进行消毒，在无菌环境下打开管盖，使用无菌吸头或接种环取少量解冻菌液（通常1-2环或10-50μL），划线接种到合适的固体平板培养基上，然后在适宜条件下培养。需注意的是，解冻后的菌液不宜再次冷冻，每次使用需取新冻存管，以保证菌种质量。
PART 04
注意事项
01 严格无菌操作
无菌操作是保藏成功的关键，任何环节的污染都可能导致保藏失败。
02控制甘油浓度
15%-20%是常用的甘油浓度范围，但不同菌株可能需要优化。浓度过低，保护效果不足；浓度过高（超过25%），可能导致细胞因渗透压失衡而脱水。
03 选择合适的菌龄
务必使用对数生长后期的健康菌体，衰老期的细胞存货率较低，会影响保藏效果。
04 把控冷冻解冻速度
快速冷冻（-80℃直接冻或程序降温）和快速解冻能够显著提高菌种存活率，缓慢操作会对细胞造成不可逆的损伤。
05 稳定保存环境
-80℃是标准保存温度，应尽量减少冰箱开关次数，避免温度波动。若条件允许，液氮保存效果更佳，但成本相对较高。
06 考虑菌株特性
并非所有微生物都适合甘油保藏，部分对低温或渗透压敏感的菌株（如某些古菌、专性厌氧菌、部分病原菌），需要采用特殊方法或保护剂，并严格遵守生物安全规定，在相应级别的生物安全实验室进行操作。
PART 05
高质量保藏，从耗材选择开始
菌种保藏不仅考验操作规范性，也依赖于高品质的实验耗材。冻存管、移液吸头、试剂瓶等耗材的性能，将直接影响菌种的活性与后续实验的可重复性。
自2009年成立以来，爱津生物专注于实验室耗材研发与生产！目前产品体系已涵盖900余种品类，全面覆盖菌种保存、分子实验、细胞培养等科研场景，持续为全球科研机构提供稳定可靠的实验耗材整体解决方案。
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爱津生物，成立于2009年
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